ეს სტატია გასწავლით თუ როგორ უნდა აირჩიოთ თხევადი ქრომატოგრაფიის სვეტი

თხევადი ქრომატოგრაფია არის ძირითადი მეთოდი თითოეული კომპონენტის შემცველობისა და მინარევების შესამოწმებლად ნედლეულში, შუალედებში, პრეპარატებსა და შესაფუთ მასალებში, მაგრამ ბევრ ნივთიერებას არ გააჩნია სტანდარტული მეთოდები, რომლებზეც დაყრდნობა, ამიტომ გარდაუვალია ახალი მეთოდების შემუშავება. თხევადი ფაზის მეთოდების შემუშავებისას ქრომატოგრაფიული სვეტი არის თხევადი ქრომატოგრაფიის ბირთვი, ამიტომ გადამწყვეტი მნიშვნელობა აქვს როგორ ავირჩიოთ შესაფერისი ქრომატოგრაფიული სვეტი. ამ სტატიაში ავტორი განმარტავს, თუ როგორ უნდა აირჩიოთ თხევადი ქრომატოგრაფიის სვეტი სამი ასპექტიდან: საერთო იდეები, მოსაზრებები და გამოყენების სფერო.

ა. საერთო იდეები თხევადი ქრომატოგრაფიის სვეტების შერჩევისთვის

1. შეაფასეთ ანალიზის ფიზიკური და ქიმიური თვისებები: როგორიცაა ქიმიური სტრუქტურა, ხსნადობა, სტაბილურობა (როგორიცაა ადვილია თუ არა მისი დაჟანგვა/შემცირება/ჰიდროლიზება), მჟავიანობა და ტუტე და ა.შ., განსაკუთრებით ქიმიური სტრუქტურა არის მთავარი. თვისებების განსაზღვრის ფაქტორი, როგორიცაა კონიუგირებული ჯგუფი, აქვს ძლიერი ულტრაიისფერი შთანთქმა და ძლიერი ფლუორესცენცია;

2. განსაზღვრეთ ანალიზის მიზანი: საჭიროა თუ არა მაღალი გამოყოფა, სვეტის მაღალი ეფექტურობა, ანალიზის მოკლე დრო, მაღალი მგრძნობელობა, მაღალი წნევის წინააღმდეგობა, სვეტის ხანგრძლივი სიცოცხლე, დაბალი ღირებულება და ა.შ.

1. აირჩიეთ შესაფერისი ქრომატოგრაფიული სვეტი: გაიგეთ ქრომატოგრაფიული შემავსებლის შემადგენლობა, ფიზიკური და ქიმიური თვისებები, როგორიცაა ნაწილაკების ზომა, ფორების ზომა, ტემპერატურის ტოლერანტობა, pH ტოლერანტობა, ანალიზის ადსორბცია და ა.შ.

1. თხევადი ქრომატოგრაფიული სვეტების შერჩევის მოსაზრებები

ამ თავში განხილული იქნება ფაქტორები, რომლებიც გასათვალისწინებელია ქრომატოგრაფიის სვეტის შერჩევისას თავად ქრომატოგრაფიის სვეტის ფიზიკური და ქიმიური თვისებების პერსპექტივიდან. 2.1 შემავსებლის მატრიცა

2.1.1 სილიკა გელის მატრიცა თხევადი ქრომატოგრაფიული სვეტების უმეტესობის შემავსებლის მატრიცა არის სილიკა გელი. ამ ტიპის შემავსებელს აქვს მაღალი სისუფთავე, დაბალი ღირებულება, მაღალი მექანიკური სიმტკიცე და ადვილად ცვლის ჯგუფებს (როგორიცაა ფენილური შემაკავშირებელი, ამინო კავშირი, ციანო კავშირი და ა. სილიკა გელის მატრიქსის შემავსებლების უმეტესობის pH დიაპაზონი არის 2-დან 8-მდე, მაგრამ სპეციალურად მოდიფიცირებული სილიკა გელის შეკრული ფაზების pH დიაპაზონი შეიძლება იყოს 1,5-დან 10-მდე და ასევე არის სპეციალურად მოდიფიცირებული სილიკა გელის შეკრული ფაზები, რომლებიც სტაბილურია დაბალ pH-ზე. როგორიცაა Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, რომელიც სტაბილურია pH 1-დან 8-მდე; სილიკა გელის მატრიცის ზედა ტემპერატურული ზღვარი ჩვეულებრივ არის 60 ℃, ხოლო ქრომატოგრაფიის ზოგიერთ სვეტს შეუძლია მოითმინოს 40 ℃ ტემპერატურა მაღალი pH-ზე.

2.1.2 პოლიმერული მატრიცა პოლიმერული შემავსებლები ძირითადად არის პოლისტიროლ-დივინილბენზოლი ან პოლიმეთაკრილატი. მათი უპირატესობები ისაა, რომ მათ შეუძლიათ მოითმინონ pH-ის ფართო დიაპაზონი - მათი გამოყენება შესაძლებელია 1-დან 14-მდე დიაპაზონში და ისინი უფრო მდგრადია მაღალი ტემპერატურის მიმართ (შეიძლება მიაღწიოს 80 °C-ს ზემოთ). სილიციუმზე დაფუძნებულ C18 შემავსებლებთან შედარებით, ამ ტიპის შემავსებელს აქვს უფრო ძლიერი ჰიდროფობიურობა და მაკროფოროვანი პოლიმერი ძალიან ეფექტურია ნიმუშების გამოყოფაში, როგორიცაა ცილები. მისი მინუსი არის ის, რომ სვეტის ეფექტურობა დაბალია და მექანიკური სიმტკიცე უფრო სუსტია, ვიდრე სილიციუმზე დაფუძნებული შემავსებლები. 2.2 ნაწილაკების ფორმა

თანამედროვე HPLC შემავსებლების უმეტესობა სფერული ნაწილაკებია, მაგრამ ზოგჯერ ისინი არარეგულარული ნაწილაკებია. სფერულ ნაწილაკებს შეუძლიათ უზრუნველყონ სვეტის ქვედა წნევა, სვეტის უფრო მაღალი ეფექტურობა, სტაბილურობა და ხანგრძლივი სიცოცხლე; მაღალი სიბლანტის მობილური ფაზების გამოყენებისას (როგორიცაა ფოსფორის მჟავა) ან როდესაც ნიმუშის ხსნარი ბლანტია, არარეგულარულ ნაწილაკებს აქვთ უფრო დიდი სპეციფიური ზედაპირი, რაც უფრო ხელს უწყობს ორი ფაზის სრულ მოქმედებას და ფასი შედარებით დაბალია. 2.3 ნაწილაკების ზომა

რაც უფრო მცირეა ნაწილაკების ზომა, მით უფრო მაღალია სვეტის ეფექტურობა და უფრო მაღალია განცალკევება, მაგრამ მით უფრო უარესია მაღალი წნევის წინააღმდეგობა. ყველაზე ხშირად გამოყენებული სვეტი არის 5 მკმ ნაწილაკების ზომის სვეტი; თუ გამოყოფის მოთხოვნა მაღალია, შეიძლება შეირჩეს 1,5-3 მკმ შემავსებელი, რომელიც ხელს უწყობს ზოგიერთი რთული მატრიცის და მრავალკომპონენტიანი ნიმუშების გამოყოფის პრობლემის გადაჭრას. UPLC-ს შეუძლია გამოიყენოს 1,5 მკმ შემავსებლები; 10 μm ან მეტი ნაწილაკების ზომის შემავსებლები ხშირად გამოიყენება ნახევრად მოსამზადებელი ან მოსამზადებელი სვეტებისთვის. 2.4 ნახშირბადის შემცველობა

ნახშირბადის შემცველობა ეხება შეკრული ფაზის პროპორციას სილიკა გელის ზედაპირზე, რაც დაკავშირებულია სპეციფიკურ ზედაპირის ფართობთან და შეკრული ფაზის დაფარვასთან. ნახშირბადის მაღალი შემცველობა უზრუნველყოფს სვეტის მაღალ მოცულობას და მაღალ გარჩევადობას და ხშირად გამოიყენება რთული ნიმუშებისთვის, რომლებიც საჭიროებენ მაღალ განცალკევებას, მაგრამ ორ ფაზას შორის ურთიერთქმედების ხანგრძლივი დროის გამო, ანალიზის დრო გრძელია; დაბალი ნახშირბადის შემცველობის ქრომატოგრაფიულ სვეტებს აქვთ უფრო მოკლე ანალიზის დრო და შეუძლიათ აჩვენონ განსხვავებული სელექციურობა და ხშირად გამოიყენება მარტივი ნიმუშებისთვის, რომლებიც საჭიროებენ სწრაფ ანალიზს და ნიმუშებს, რომლებიც საჭიროებენ მაღალი წყლის ფაზის პირობებს. ზოგადად, C18-ის ნახშირბადის შემცველობა მერყეობს 7%-დან 19%-მდე. 2.5 ფორების ზომა და სპეციფიკური ზედაპირის ფართობი

HPLC ადსორბციული მედია არის ფოროვანი ნაწილაკები და ურთიერთქმედების უმეტესობა ხდება ფორებში. ამიტომ, მოლეკულები უნდა შევიდნენ ფორებში, რათა შეიწოვება და განცალკევდეს.

ფორების ზომა და ზედაპირის სპეციფიკური ფართობი ორი დამატებითი ცნებაა. ფორების მცირე ზომა ნიშნავს დიდ სპეციფიკურ ზედაპირს და პირიქით. დიდი სპეციფიკური ზედაპირის ფართობს შეუძლია გაზარდოს ურთიერთქმედება ნიმუშის მოლეკულებსა და შეკრულ ფაზებს შორის, გააძლიეროს შეკავება, გაზარდოს ნიმუშის დატვირთვა და სვეტის მოცულობა და რთული კომპონენტების გამოყოფა. ამ ტიპის შემავსებლებს მიეკუთვნება სრულად ფოროვანი შემავსებლები. მათთვის, ვისაც მაღალი მოთხოვნები აქვს განცალკევებისთვის, რეკომენდებულია შემავსებლების შერჩევა დიდი სპეციფიკური ზედაპირის ფართობით; მცირე სპეციფიურ ზედაპირს შეუძლია შეამციროს უკანა წნევა, გააუმჯობესოს სვეტის ეფექტურობა და შეამციროს წონასწორობის დრო, რაც შესაფერისია გრადიენტური ანალიზისთვის. Core-shell შემავსებლები მიეკუთვნება ამ ტიპის შემავსებლებს. განცალკევების უზრუნველსაყოფად, რეკომენდებულია მცირე სპეციფიკური ზედაპირის მქონე შემავსებლების შერჩევა მათთვის, ვისაც აქვს მაღალი ანალიზის ეფექტურობის მოთხოვნები. 2.6 ფორების მოცულობა და მექანიკური სიმტკიცე

ფორების მოცულობა, რომელიც ასევე ცნობილია როგორც "ფორების მოცულობა", ეხება ცარიელი მოცულობის ზომას ერთეულ ნაწილაკზე. მას შეუძლია კარგად ასახოს შემავსებლის მექანიკური ძალა. დიდი ფორების მოცულობის შემავსებლების მექანიკური სიძლიერე ოდნავ სუსტია, ვიდრე მცირე ფორების მოცულობის შემავსებლები. 1,5 მლ/გ-ზე ნაკლები ან ტოლი ფორების შემავსებლები ძირითადად გამოიყენება HPLC-ის გამოყოფისთვის, ხოლო 1,5 მლ/გ-ზე მეტი ფორების მოცულობის შემავსებლები ძირითადად გამოიყენება მოლეკულური ექსკლუზიური ქრომატოგრაფიისთვის და დაბალი წნევის ქრომატოგრაფიისთვის. 2.7 დაფარვის მაჩვენებელი

დაფარვას შეუძლია შეამციროს ნაერთებისა და სილანოლის ჯგუფებს შორის ურთიერთქმედებით გამოწვეული კუდის მწვერვალები (როგორიცაა იონური კავშირი ტუტე ნაერთებსა და სილანოლის ჯგუფებს შორის, ვან დერ ვაალის ძალები და წყალბადური ბმები მჟავე ნაერთებსა და სილანოლის ჯგუფებს შორის), რითაც აუმჯობესებს სვეტის ეფექტურობას და პიკის ფორმას. . დაუფარავი შეკრული ფაზები წარმოქმნის სხვადასხვა სელექციურობას დახურულ შეკრულ ფაზებთან შედარებით, განსაკუთრებით პოლარული ნიმუშებისთვის.

1. სხვადასხვა თხევადი ქრომატოგრაფიის სვეტების გამოყენების სფერო

ეს თავი აღწერს თხევადი ქრომატოგრაფიის სხვადასხვა ტიპის სვეტების გამოყენების ფარგლებს ზოგიერთ შემთხვევაში.

3.1 შებრუნებული ფაზის C18 ქრომატოგრაფიული სვეტი

C18 სვეტი არის ყველაზე ხშირად გამოყენებული შებრუნებული ფაზის სვეტი, რომელსაც შეუძლია დააკმაყოფილოს ორგანული ნივთიერებების უმრავლესობის შემცველობა და მინარევების ტესტები და გამოიყენება საშუალო პოლარული, სუსტად პოლარული და არაპოლარული ნივთიერებებისთვის. C18 ქრომატოგრაფიული სვეტის ტიპი და სპეციფიკაცია უნდა შეირჩეს გამოყოფის სპეციფიკური მოთხოვნების შესაბამისად. მაგალითად, მაღალი გამიჯვნის მოთხოვნების მქონე ნივთიერებებისთვის ხშირად გამოიყენება 5 μm*4.6 მმ*250 მმ სპეციფიკაციები; რთული განცალკევების მატრიცების და მსგავსი პოლარობის მქონე ნივთიერებებისთვის შეიძლება გამოყენებულ იქნას 4 μm*4.6 მმ*250 მმ სპეციფიკაციები ან ნაწილაკების უფრო მცირე ზომები. მაგალითად, ავტორმა გამოიყენა 3 μm*4.6 მმ*250 მმ სვეტი სელეკოქსიბის API-ში ორი გენოტოქსიური მინარევების გამოსავლენად. ორი ნივთიერების გამიჯვნა შეიძლება მიაღწიოს 2.9-ს, რაც შესანიშნავია. გარდა ამისა, განცალკევების უზრუნველსაყოფად, თუ საჭიროა სწრაფი ანალიზი, ხშირად ირჩევენ მოკლე სვეტს 10 მმ ან 15 მმ. მაგალითად, როდესაც ავტორმა გამოიყენა LC-MS/MS გენოტოქსიური მინარევების გამოსავლენად პიპერაქინის ფოსფატის API-ში, გამოყენებული იყო 3 μm*2.1 მმ*100 მმ სვეტი. მინარევებსა და ძირითად კომპონენტს შორის განცალკევება იყო 2.0, ხოლო ნიმუშის აღმოჩენა შეიძლება დასრულდეს 5 წუთში. 3.2 შებრუნებული ფაზის ფენილის სვეტი

ფენილის სვეტი ასევე არის შებრუნებული ფაზის სვეტის ტიპი. ამ ტიპის სვეტს აქვს ძლიერი სელექციურობა არომატული ნაერთებისთვის. თუ ჩვეულებრივი C18 სვეტით გაზომილი არომატული ნაერთების რეაქცია სუსტია, შეგიძლიათ განიხილოთ ფენილის სვეტის შეცვლა. მაგალითად, როდესაც ვამზადებდი ცელეკოქსიბის API-ს, ძირითადი კომპონენტის პასუხი, რომელიც იზომება იმავე მწარმოებლის ფენილის სვეტით და იგივე სპეციფიკაციებით (ყველა 5 μm*4.6 მმ*250 მმ) დაახლოებით 7-ჯერ აღემატებოდა C18 სვეტს. 3.3 ნორმალური ფაზის სვეტი

როგორც შებრუნებული ფაზის სვეტის ეფექტური დანამატი, ნორმალური ფაზის სვეტი შესაფერისია მაღალპოლარული ნაერთებისთვის. თუ პიკი ჯერ კიდევ ძალიან სწრაფია 90%-ზე მეტი წყლის ფაზის გამორეცხვისას შებრუნებული ფაზის სვეტში და ახლოსაც კი და გადაფარავს გამხსნელის პიკს, შეგიძლიათ განიხილოთ ნორმალური ფაზის სვეტის შეცვლა. ამ ტიპის სვეტი მოიცავს ჰილის სვეტს, ამინო სვეტს, ციანოს სვეტს და ა.შ.

3.3.1 ჰილის სვეტი ჰილის სვეტი ჩვეულებრივ ათავსებს ჰიდროფილურ ჯგუფებს შეკრულ ალკილის ჯაჭვში, რათა გააძლიეროს რეაქცია პოლარულ ნივთიერებებზე. ამ ტიპის სვეტი შესაფერისია შაქრის ნივთიერებების ანალიზისთვის. ავტორმა გამოიყენა ამ ტიპის სვეტი ქსილოზის და მისი წარმოებულების შემცველობისა და მასთან დაკავშირებული ნივთიერებების შედგენისას. ქსილოზის წარმოებულის იზომერები ასევე შეიძლება კარგად განცალკევდეს;

3.3.2 ამინო სვეტი და ციანოს სვეტი ამინო სვეტი და ციანო სვეტი ეხება ამინო და ციანო მოდიფიკაციების შემოღებას შეკრული ალკილის ჯაჭვის ბოლოს, შესაბამისად, სპეციალური ნივთიერებების სელექციურობის გასაუმჯობესებლად: მაგალითად, ამინო სვეტი კარგი არჩევანია. შაქრების, ამინომჟავების, ფუძეების და ამიდების გამოყოფისათვის; ციანოს სვეტს აქვს უკეთესი სელექციურობა ჰიდროგენირებული და არაჰიდროგენირებული სტრუქტურული მსგავსი ნივთიერებების გამოყოფისას კონიუგირებული ბმების არსებობის გამო. ამინო სვეტი და ციანო სვეტი ხშირად შეიძლება გადართვას ნორმალურ ფაზის სვეტსა და საპირისპირო ფაზის სვეტს შორის, მაგრამ ხშირი გადართვა არ არის რეკომენდებული. 3.4 ქირალური სვეტი

ქირალური სვეტი, როგორც სახელი გვთავაზობს, შესაფერისია ქირალური ნაერთების გამოყოფისა და ანალიზისთვის, განსაკუთრებით ფარმაცევტულ სფეროში. ამ ტიპის სვეტი შეიძლება ჩაითვალოს, როდესაც ჩვეულებრივი საპირისპირო და ნორმალური ფაზის სვეტები ვერ მიაღწევენ იზომერების განცალკევებას. მაგალითად, ავტორმა გამოიყენა 5 μm*4.6 მმ*250 მმ ქირალური სვეტი 1,2-დიფენილეთილენდიამინის ორი იზომერის გამოსაყოფად: (1S, 2S)-1, 2-დიფენილეთილენდიამინი და (1R, 2R)-1, 2. -დიფენილეთილენდიამინი და ამ ორს შორის განცალკევებამ მიაღწია დაახლოებით 2.0-ს. თუმცა, ქირალური სვეტები უფრო ძვირია, ვიდრე სხვა ტიპის სვეტები, ჩვეულებრივ 1W+/ცალი. თუ არსებობს ასეთი სვეტების საჭიროება, ერთეულმა უნდა შეადგინოს საკმარისი ბიუჯეტი. 3.5 იონგაცვლის სვეტი

იონის გაცვლის სვეტები შესაფერისია დამუხტული იონების გამოყოფისა და ანალიზისთვის, როგორიცაა იონები, ცილები, ნუკლეინის მჟავები და ზოგიერთი შაქრის ნივთიერება. შემავსებლის ტიპის მიხედვით, ისინი იყოფა კატიონგაცვლის სვეტებად, ანიონგაცვლის სვეტებად და ძლიერ კათიონგაცვლის სვეტებად.

კათიონების გაცვლის სვეტები მოიცავს კალციუმზე დაფუძნებულ და წყალბადზე დაფუძნებულ სვეტებს, რომლებიც ძირითადად შესაფერისია კათიონური ნივთიერებების, როგორიცაა ამინომჟავების ანალიზისთვის. მაგალითად, ავტორმა გამოიყენა კალციუმზე დაფუძნებული სვეტები კალციუმის გლუკონატის და კალციუმის აცეტატის ანალიზისას გამრეცხ ხსნარში. ორივე ნივთიერებას ჰქონდა ძლიერი რეაქცია λ=210ნმ-ზე და გამოყოფის ხარისხი მიაღწია 3.0-ს; გლუკოზასთან დაკავშირებული ნივთიერებების ანალიზისას ავტორმა წყალბადზე დაფუძნებული სვეტები გამოიყენა. რამდენიმე ძირითად დაკავშირებულ ნივთიერებას - მალტოზას, მალტოტრიოზას და ფრუქტოზას - ჰქონდა მაღალი მგრძნობელობა დიფერენციალური დეტექტორების ქვეშ, გამოვლენის ლიმიტი 0.5 ppm-მდე და განცალკევების ხარისხი 2.0-2.5.

ანიონის გაცვლის სვეტები ძირითადად შესაფერისია ანიონური ნივთიერებების ანალიზისათვის, როგორიცაა ორგანული მჟავები და ჰალოგენური იონები; ძლიერი კათიონური გაცვლის სვეტებს აქვთ იონგაცვლის უფრო მაღალი სიმძლავრე და სელექციურობა და შესაფერისია რთული ნიმუშების გამოყოფისა და ანალიზისთვის.

ზემოაღნიშნული მხოლოდ შესავალია რამდენიმე ჩვეულებრივი თხევადი ქრომატოგრაფიის სვეტის ტიპებისა და გამოყენების დიაპაზონში, ავტორის საკუთარ გამოცდილებასთან ერთად. არსებობს სხვა სპეციალური ტიპის ქრომატოგრაფიული სვეტები რეალურ აპლიკაციებში, როგორიცაა დიდი ფორების ქრომატოგრაფიული სვეტები, მცირე ფორების ქრომატოგრაფიული სვეტები, აფინური ქრომატოგრაფიული სვეტები, მრავალმოდური ქრომატოგრაფიული სვეტები, ულტრა მაღალი ხარისხის თხევადი ქრომატოგრაფიის სვეტები (UHPLC), სუპერკრიტიკული სითხის სვეტები (ქრომატოგრაფიული სვეტები). SFC) და ა.შ. ისინი მნიშვნელოვან როლს ასრულებენ სხვადასხვა სფეროში. ქრომატოგრაფიული სვეტის კონკრეტული ტიპი უნდა შეირჩეს ნიმუშის სტრუქტურისა და თვისებების, გამოყოფის მოთხოვნებისა და სხვა მიზნების მიხედვით.